實驗原理

利用低濃度去垢劑選擇性裂解細(xì)胞膜，同時保持核膜完整，然后通過差速離心進(jìn)行分離。

1.選擇性裂解：

使用含有低濃度非離子去垢劑的等滲緩沖液。這種濃度足以溶解細(xì)胞膜和胞漿膜結(jié)構(gòu)，但無法破壞結(jié)構(gòu)更堅固的核膜。

2.差速離心：

通過控制離心力，可以初步將細(xì)胞核（沉淀）與胞漿成分（上清）分離開。

1）低速離心：完整的細(xì)胞核是細(xì)胞中最大最重的細(xì)胞器，在較低轉(zhuǎn)速下（500-1,000g）即可沉淀。

2）高速離心：胞漿蛋白、細(xì)胞器（線粒體、微粒體等）需要更高的轉(zhuǎn)速（10,000g以上）才能沉淀。

操作步驟

第一步：細(xì)胞收集與洗滌：

1）吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基；

2）用預(yù)冷的PBS輕柔地洗滌細(xì)胞2次，充分洗去殘留的血清（血清中含蛋白酶）；

3）充分吸盡PBS。

Tip：使用胰酶處理貼壁細(xì)胞時要嚴(yán)格注意消化時間；胰酶會使細(xì)胞變得很脆弱，影響后續(xù)核質(zhì)分離；不同細(xì)胞種類其核質(zhì)分離結(jié)果略有所不同。

圖片中左側(cè)為細(xì)胞數(shù)量是2×10⁶個數(shù)的CHO-S細(xì)胞（黃色細(xì)胞沉淀）；圖片右側(cè)為細(xì)胞數(shù)量1×10⁵個數(shù)的Raw（白色細(xì)胞沉淀），作為反面對照，細(xì)胞個頭較小，數(shù)量太少，對后續(xù)提出的蛋白濃度以及核漿分離結(jié)果有較大的影響。

第二步：細(xì)胞裂解：

1）加入一定量的裂解液裂解細(xì)胞；

2）渦旋振蕩10-15秒（或劇烈吹打），以充分裂解細(xì)胞。此時應(yīng)觀察到液體變得非常粘稠（因DNA釋放）；

3）冰上孵育10-15分鐘。此時，細(xì)胞會因裂解而變得粘稠，透亮。

Tip：2×10⁶個細(xì)胞體積通常為20μL，需要使用細(xì)胞計數(shù)儀檢測密度后，再取2×10⁶個細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

第三步：離心分離：

1）在4°C, 1000g離心5-10分鐘；

2）離心后，溶液分為兩層：

A.上面一層是上清(Supernatant)：即為胞漿蛋白提取物；小心將其轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷離心管中，二次離心，確保細(xì)胞漿蛋白的干凈無污染。

B.下面的沉淀(Pellet)：包含完整的細(xì)胞核以及未破碎的完整細(xì)胞、細(xì)胞骨架等，等待后續(xù)細(xì)胞核蛋白的裂解。

第四步：洗滌細(xì)胞核（關(guān)鍵純化步驟）：

1）向沉淀中加入適量預(yù)冷的細(xì)胞漿裂解緩沖液；用移液器非常輕柔地重懸沉淀；

2）再次在4°C,1000 g離心5分鐘；

3）小心吸棄上清；此時得到的沉淀是較純的細(xì)胞核。

Tip：吸頭切勿觸及細(xì)胞沉淀，為降低胞漿組分對細(xì)胞核組分的污染，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，換用10 μL的吸頭盡可能吸盡，必要時可將極小體積上清棄掉。

第五步：核蛋白提取

1）向洗凈的細(xì)胞核沉淀中加入適量的預(yù)冷細(xì)胞核裂解緩沖液；

2）在4°C下，通過渦旋或輕柔吹打重懸沉淀，并在搖床上孵育40分鐘，使核膜裂解，核蛋白充分釋放；

3）在4°C 13000g 離心10分鐘。小心吸取上清，即為核蛋白提取物；將胞漿蛋白和核蛋白分裝后，于-80°C保存。

Tip：為保證提取的核蛋白干凈無污染，吸取時，可以在沉淀上方棄掉小部分上清。

提取蛋白時，出現(xiàn)的相關(guān)問題

1、核質(zhì)分離不充分，出現(xiàn)交叉污染：

2、核蛋白提取效率低：

3、其他問題：

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